抽象性

百分百复发症(PTB)由mycobctiuma子sp.paratuberculosismap.优化APP测试对改善PTB控制至关重要以ELISA为基础开发并验证诊断工具 专门检测牛血清样本中的抗MAP抗体为此目的,我们设计重组合多蛋白,装有MAP四大抗原并优化ELISA验证内容包括对10Sera评估PTB染色体和健康牛体不同OD值多蛋白ELISA诊断性能通过测试130牛血清样本(47个健康样本、48个MAP受感染样本和35个样本)评价M.bovis系统受感染牛群)ELISA使用多蛋白生成ROC曲线下面积0.9912(95%CI,0.9758-1.007; < murn01>对ELISA来说,取自ROC曲线的截取值为95.56%(95%CI,0.8485-0.9946)和97.92特性(95%CI,0.8893-0.9995)为0.3328ELISA使用商业百草枯原型抗原获取类似结果ELISA带多蛋白抗原显示比动物感染Sera性能更好mycoctiumbovis对比ELISAPA:低交互性2.85%对25.71%检测结果显示多蛋白与受感染动物血清样本中的抗体交互性极低M.博比斯设计多蛋白和验证ELISA对具体识别群落中受MAP感染的动物非常有用

开工导 言

强氏病世界许多地方的局部性疾病,即高传染性慢性累进性剖腹炎,给牲畜和相关行业造成重大损失[一号物学代理mycobctiuma子sp.paratuberculosisMAP)2..最常见的感染路径是摄取受污染的牛奶、共生或大便3..6个月以下小牛受感染风险较高,但风险在后会下降4..IMAP项由肠状M细胞介导并优先置居主机大字组或早期内分解中,主要是那些与ialpeer补丁相联5..

临床信号出现在疾病的高级阶段,这使得诊断难易并转而偏向病原体散居群 [6..微机通常主要引起牛群慢性粒状肠炎,但MAP还可能影响山羊、绵羊和鹿等其他宿主7-九九..

PTB造成的经济损失与死亡、及早消除动物、更易染上其他传染性疾病、减少牛奶、肉类和生殖增产等相关10-12..此外,MAP与人类Crohn疾病相关联,即与慢性肠耗竭相关联的自动机性疾病,表明动物学关联性[13..

现有商业疫苗基于非活性菌株,有效减少了通过粪便消除子宫和有临床症状动物百分比但它们未能预防APP感染14,15并可以干扰诊断牛结核16..正因如此,牛群管理程序即分离或消除受PTB感染的动物17举个例子说明数国控制PTB使用的主要策略18号..PTB控制程序的成功取决于使用诊断测试的性能

PTB难以控制消除,原因是它孕育期长,诊断测试敏感度低检测处于疾病初级阶段的动物初始接触a南锥体inleukin-1(IL-1)、IL-6和IL-219号..测量隐蔽IFN南锥体是在感染早期阶段检测动物受MAP20码..

特殊测试基础IFN南锥体16个月以下动物评估低21号..况且 识别IFN南锥体阳性动物后应使用其他诊断方法,如ELISA或MAP fecalshate22号,23号..诊断测试中,粪肥、牛奶、血液和组织对MAP的培养被认为是检测MAP感染的黄金标准24码..MAP隔离费用昂贵、耗时耗时,在过程期间需要几步去污25码..fecal文化敏感度在临床受感染牛中为+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++22222222222222222222222222222222222222++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++反之,实时PCR解析比排泄物文化敏感度高,并快速和具体诊断PTB然而,基于PCR测试因其成本在兽医实验室不常见26..

Serlogic测试,特别是ELISA测试费用低廉、易操作并易自动化高样本吞吐量ELISA检测抗体27号..ELISA测试的敏感度因疾病阶段(初级和次初级阶段低)、粪便淡化水平和动物时代而异28码..ELISA检测约30-40%的牛 被确定为受固体介质粪肥文化感染29..提高系统测试的敏感度和特性需要识别定义清晰的抗原,更考虑到单子抗原很难检测处于不同阶段的所有动物ELISA迄今使用抗原包括粗化AP细胞提取物、商业Patuberculisprotolicative抗原(PPA)、隐式抗原、细胞墙和薄膜抗原、脂质素、热休克蛋白质(HSP)和复用蛋白[30码-35码..

从这个意义上讲,使用抗原鸡尾酒或配有特殊顶点的多蛋白可成为一种有趣的替代方法,增加在不同阶段检测受感染动物的机率,主要是在次临床感染阶段受感染动物,当MAP悬浮和免疫响应不那么显眼时。

本研究的目的是开发并验证ELISA对抗体进行具体检测M.avium子sp.paratuberculosis牛角为此目的,我们设计出一个cimeric多蛋白,内含MAPK-10参考线性序列四大顶部

二叉材料方法

2.1.奇美里多蛋白设计E.西里岛表达式

esherichia大肠杆菌BL21(DE3)pysss华府g/ml向Luria Bertani(LB)汤或agar

MAPK-10四种抗原的蛋白序列(MAP0038、MAP0209c、MAP2513c和MAP1589c)选用于多蛋白设计http://www.Uniprot.org)使用BepiPed-2.0程序预测抗原序列中的B-Cehttp://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)[36号..复构多蛋白由Genscript合成(Jinstation科技公司,南京市)共593核素并分四块B多蛋白在矢量pET-23a+中克隆后表达E.西里岛BL21pysss辰族20摄氏度时16h

由此产生的提取物通过染色法与镍树脂相似性净化,根据制造商指令(Qiagen,Hilden,德国)。4摄氏度时聚用并拨通通宵PBS纯化多蛋白aliquts存储于-20摄氏度SDS-PAGE凝胶与Cooassie蓝染色

2.2.聚效蛋白表达式和自生性评价

Proteins分解12%SDS-PAGE后染色0.25%Comassie精蓝R250(Sigma-Aldrich)或转入硝化细胞膜聚蛋白表达式因西方染色使用1:3000稀释反His(GEHSHCEGE)为主抗体和碱性磷化反应反模IgG(Sigma-Aldrich)为二级抗体(1:3000稀释色度检测使用BCIP/NBT(5-BDE-4-CL3-indoly

多蛋白解法华府L!40码华府g/ml)播种并运行Proteins转至Nitrocellose膜(GE保健网),切入约0.5cm条区间温度为1H,已知特征不同的牛角稀释为1:5%非脂肪干牛奶/0.1%(v/v/v)Tris-缓冲saline0.1%Tween20条状三次用T-TBS冲刷并最后在室温下孵化1H并用磷化同序反波音稀释为1:5 000在T-TBS中作为二级抗体色度检测使用BCIP/NBT(5-BRO-4-CL3-indoly

2.3ELISA检测抗体对抗MAPM.bovis系统

PPA-ELISA和多素ELISA检测抗体M.bovis系统由受感染健康动物生成的Sera使用经验证bTBELISA37号..

简言之,聚苯微调ELISA板(Nunc MaxiSorp,TermoFishScience,USA)涂上100华府碳酸盐缓冲液(0.1M单碳酸钠,0.1M碳酸钠,pH9.6)华府g或多蛋白或PPA抗原(United Monitor Inc.,USA)或33.8纳克抗原混合检测M.bovis系统抗体并随后在4摄氏度夜间孵化水井用0.2%porcine gelatinaa(Sigma-Aldrich,USA)阻塞后再用PBST冲刷塞拉市华府路韦尔1:PBS中稀释百分数水井用PBST冲刷后再加倍效标签亲和质G(BioRad实验室,USA)液态缓冲二叉二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-三叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-三叉-二叉-二叉-三叉-三叉-二叉-三叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-三叉-三叉-二叉-二叉-二叉-三叉-二叉-三叉-三叉-三叉-三叉-三叉-三叉-三叉-二叉-三叉-三叉-二叉-三叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二叉-二三三三三三叉-二-二-二二三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二三三三三三二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二二三三三二二二二二二二二二二二二二三三三三三二二二二二二二二二二二二二二二三三三三三三三三三三三三三三三三

半量化标准曲线用于分析灵敏度评价,使用硫酸铵净化生物免疫球素(0-1mg)实现OD值与mgms/ml相关联简言之,净化牛免疫球素涂上100华府L碳酸缓冲为1h37摄氏度,后用0.2%porcinegelatinA阻塞,最后使用蛋白G-HRP和ABTS披露剖析敏感度(检测限值)使用1:100稀释负SeraN级=47)分析灵敏度使用公式计算σ标准偏差负Sera38号..5PTB阳性Sera双串稀释(1:100-1:6.400)用于比较ELISA

每种样本的抗体反射用正确ODOD表示405dd 405nm采样水井除OD405nm控件

2.4.血清样本

本研究使用来自47个健康牛群(PTB/BTB免费)、48个MAP受感染牛群(PTB受感染)和35个样本M.bovis系统受感染牛健康动物属于无PTB和无BTB群体,十年多没有这些疾病的踪迹,并产生负效果PCR或粪生成法检测Truculin皮肤测试负结果和屠宰检测bTB检测是健康组的另一条件

PTB受感染的48只动物中的MAP感染经 mycobactia与faces隔离确认,PCR再放大插入序列ISIS900.最后,根据SENASA授权的屠宰场坏死诊断确认35头BTB动物感染组织通过放大IS测试聚合物链反射6110中插入序列mycoctium结核病复杂37号..这35只动物属于15年多没有PTB的牛群

CICVYA-INTA机构动物保护使用委员会授权进行这项研究,该委员会的条例与欧洲联盟保护动物法一致。

阿里夸特sera存储到-20°C

2.5ELISA标准化和重复性

不同的试剂集中度和孵化时间被评估优化测试条件并使之标准化后在分析验证分析的10个血清样本中确定可重复性,并表现为研究中每种样本中30个运算中经校正OD变异系数使用10个血清样本中,6Sera归并光密度介于0.4至0.75和4Sera归并光密度 <0.2的健康动物(PTB/BTB免费)ELISA运行中所有Sera都复制

2.6截取性、敏锐度和特性分析ROC

接收者特征PPA-ELISA和聚蛋白ELISA曲线使用GreatPad软件演化为此目的,对归为健康动物样本(PTB/BTB免费牛类47个血清样本)或经确认受感染动物样本IS系统900PCR放大法(48个血清样本受MAP感染牛)用于确定

ERISA最佳截取值通过ROC分析分析确定,以获取95%置信区间(95%CI)敏感度和特性最佳组合

2.7数据分析

方法、变异系数和标准偏差用微软WindowsExcel计算统计分析使用GraphPad软件5.00校正OD方法在不同组别分析t级测试分析组为无病牛(PTB/BTB-free)、MAP受感染牛(PTB-effected)或M.bovis系统受感染牛

3级结果

3.1.聚效蛋白表达式和自生性评价

根据我们组前结果和其他出版物显示,本研究多蛋白设计所选择的抗原是那些仅从受MAP感染的动物身上检测到的M.bovis系统[三十九,40码..重组合多蛋白成功表达,用反His反体西线图证明1(a))

(a)
(a)
(b)
(b)
图1
多蛋白表达式和自生性评价西方烟雾使用反His(1:3000)为主抗体和碱性磷化复用反mouseIgG为二级抗体(1:3000)。色度检测使用BCIP/NBT(5-BDE-4-CL3-indoly多元蛋白素抗原性评价预设12%聚丙烯凝胶并加聚蛋白解法 华府l!40码 华府g/ml)硝化细胞膜带1H室温接触已知特性不同的牛角(1:100)后,1H室温进一步孵化1H室温后加磷化抗波体(1:5 000)色度检测使用BCIP/NBT并用b显示有代表性图像分子权重负血清样本+:阳性血清样本

评价所获取净化多蛋白包括增量并运行100华府i解析方法折叠12%多环虫预断凝胶之后,蛋白质转至硝化细胞膜并切入条状,从健康牛群或从确认受MAP染色的牛群接触Sera分析健康区(8个血清样本)或APP受感染区(7个血清样本)动物的15个Sera显示,只有APP受感染区动物的Sera检测到多蛋白1(b))健康动物Sera检测到无异信号

3.2ELISA优化分析验证

第一,ELISA技术最优化化包括分析多蛋白的不同富集度以及清洗和孵化时间,10Sera来自各种状态和不同OD值(6正和4负)的动物样本只包含缓冲区,并列为负控件(缓冲)。分析结果显示高可重复性,变化系数低于25%(表)即为证明一号)

表1
可重复性评估结果10Sera中均值标准偏差和变异系数CV=SD/une)

关于分析灵敏度评价,ELISA检测到测试Sera中相同的抗体tier限值,检测限值为1.49华府PPA-ELISA和2.13华府g/ml多蛋白ELISA

3cm3截取性、敏锐度和特性分析ROC

开发多蛋白ELISA抗体检测诊断性能通过测试95个血清样本评价,这些样本归为阳性(48个血清样本来自APP受感染动物、PTB受感染者)或负性(47个血清样本来自健康动物、PTB/BTB免染色),根据前一次结果显示,这些样本在培养法中与随后IS900PCR放大ROC曲线分析对ELISA都进行选择最优截值并估计诊断敏感度和特性,视每一种可能的截点而定使用商业抗原PA的ELISA分析同样的血清样本,实验室对MAP例行检测抗体

ROC曲线下面积为0.9912(95%CI, 0.9758-1.007; <0.0001或0.9907(95%CI, 0.9729-1.008; ELISA使用多蛋白并使用PPA抗原2)AUC两个值的形状和关联性都显示ELISA高精度

(a)
(a)
(b)
(b)
图2
诊断性验证多蛋白ELISAROC曲线分析使用多蛋白(a)和PPA(b)作抗原并用95Sera样本执行,这些样本按前一结果归为正或负 900PCR放大右面板显示不同切分列表,并有各自的敏感度和特性选择截点及其相应的敏感度和特性用粗体表示

从ROC多蛋白ELISA曲线选择截取值95.56%(95%CI, 0.8485-0.9946)和特性97.92%(95%CI, 0.8893-0.9995)为0.3282(a))关于ROCPA-ELISA曲线,截取数为0.4363,敏感度97.87%(95%CI,0.8871-0.995)和特性97.92%(95%CI,0.8893-0.9995)2(b))

根据为每个ELISA选择的截取点计算,评价抗原产生两种健康动物假阳性值,PPA只识别一种假阳性值另一方面,Sera没有观察到虚负响应与多蛋白反之,PPA抗原产生假阴性3)

(a)
(a)
(b)
(b)
图3
ELISA使用多蛋白作抗原并比较PPA-ELISA405nm校正OD 405nm样本减OD 405nm缓冲由多蛋白ELISA(a)和PPAELISA(b)获取95评价Sera(47Sera from Healthbovines和48Sera fromMAP受感染bovenes)诊断验证技术破折线表示截取点 通过分析ROC曲线为每个ELISA选择Wilcoxon分析显示无PTB和受PTB感染群体之间存在巨大差异( < murn01>
3.4.ELISA波文Sera交叉活动mycoctiumbovis

诊断方法检测MAP的一个主要问题,是交叉反应式与反源组件存在于其他晶体正因如此,下一步是评价反源组件的交互性M.bovis系统通过分析优化ELISA和从PTB/BTB免费健康动物中建立断点N级=47)M.bovis系统受感染动物N级=35)

结果,ELISA使用多蛋白生成阳性M.bovis系统后一ELISA检测出九分假阳性4).多蛋白抗原优于PPA(跨响应率分别为2.85%对25.71%)。

(a)
(a)
(b)
(b)
图4
ELISA交叉活动 mycoctiumbovis405nm校正OD 405nm样本减OD 405nmspoteinELISAa和PPAELISAb获取95评价Sera中(47Sera来自健康牛群和35Sera来自健康牛群和35Sera) M.bovis系统受感染牛群分析 M.bovis系统.破折线表示通过分析ROC曲线选择的截点Wilcoxon分析显示无PTB和TB受感染群体之间存在巨大差异( < murn01>

4级讨论

近些年来,在开发 mycobile诊断方法方面取得了重要成绩。优化检测策略识别受MAP感染的动物仍然至关紧要原因之一是,迄今可用测试的特殊性在接触或感染其他近效机时受到严重影响,因为这些生物体中某些抗原成分相似性以及生长缓慢、难以隔离等[41号-43号..开发并优化敏感MAP检测技术可提高控制策略效率,这将对减少聚类中PTB的流行产生重要影响。

当前,最常用于PTB检测的血清测试之一是间接ELISA测试,它使用商业抗原PPA或MAP净化抗原提取物数项商业血清测试(IDvetELISA、IDEXX实验室ELISA、SERELISAPRATB等)目前可用,但费用昂贵,多加预吸附级M.phlei语言显示某些差异检测所有受感染动物44号,45码..

ELISA特性介于40%至100%之间,视多种因素而定,例如使用抗原、先前接触环境线形机、与其他线形机并发和先前接触管状测试以检测bTB46号..从这个意义上讲,选择抗原和/或抗原对ELISA性能至关重要先前,研究人员使用不同的生物标志从受感染或受感染者中检测APPS332码-35码..

在当前研究中,我们设计、表达并使用多蛋白作为抗原开发ELISA,基础是先前对MAP54个蛋白从健康或受感染(与MAP或受IMP或受感染)M.bovis系统动物三十九并计及前另一项研究,即MAP1589c具体诊断PTB40码..计及所有这些数据后,选择设计多蛋白的抗原为MAP0038、MAP0209c、MAP2513c和MAP1589c,因为这些抗原仅由MAP受感染动物Sera检测,没有与健康动物或健康动物或Sera交互反应M.bovis系统受感染动物

聚质ELISA开发显示高精度(AUC.0.9912)高敏感度(95.56%)和特性(97.92%)选取截取值(0.328)。实验方法对评价开发ELISA性能提出了某些限制,因为疾病复杂度和所分析动物总数

使用另一种常用商业抗原使我们能比较开发ELISA性能ELISA评价参数所得结果极相似所观察到的主要差异是受感染动物在Sera的交互活动结果M.bovis公司ELISA开发在这里显示更好的性能

百分位复发显示与不同相位感染相联的广度免疫学和病理学阶段从这个意义上讲,没有任何单子抗原能检测所有受感染动物41号..这一事实在选择合适的抗原开发诊断技术以在畜群中检测多丁二烯方面是一个重大挑战在这种情况下,使用抗原混合或多蛋白可能是开发语学测试中一种有趣的替代方法,因为多顶点的存在增加在不同阶段检测动物的几率上项研究中,用868净化重组蛋白并用180牛排Sera评价的MAP蛋白微数组识别数个抗原,这些抗原为MAP受感染牛拉在不同阶段发现疾病所识别。研究缺少交互性分析30码..

另一方面,MAP感染增加感染概率M.bovis系统复发概率比2.35倍高并增加易感染性,如牛头炎47..并发动物(动物受MAP和M.bovis系统map受感染干扰诊断bTB证明BTB假底片增加与bTB群[bTB群中Truculin皮肤测试47..Roupie和同事还检测到BTB-ELISA与抗原混合物敏感度下降M.bovis系统并发48号..事实前研究证明牛自然受感染M.bovis系统PTB-ELISA测试时可产生假正反射49号..

除其他外,这些报告表示具体诊断PTB和BTB的重要性,以及评估某些群中两种疾病以避免误诊断的重要性误诊断可诱发对疾病和随后因不必要消除假阳性动物而蒙受经济损失的不适当控制措施

基于所有这些报告,在本研究中,我们决定评价ELISA性能M.bovis系统.交互作用触发SeraM.bovis系统受感染动物使用所选多蛋白极低2.85%,这表明这对具体诊断MAP非常有用

5级结论

ELISA开发在这里可能是一个实用工具,因为多蛋白识别受MAP感染的动物,不显示与受感染动物的显性交互反应M.bovis系统.这将使高效卫生策略单独或兼有病群应用,而这反过来对控制PTB传播大有裨益。此外,使用开发工具可能有用评估植物群实际流行程度,对这种疾病进行流行病学研究,并监测植物群中植物群发展等

迄今所获结果令人鼓舞,但需要更多研究加深测试诊断性能,未来研究应评价测试(包括BTB受感染动物和PTB组内的其他生成物)。

数据可用性

支持本研究发现的数据包括在文章内并会应请求从相关作者处获取额外资料

利益冲突

作者声明无利益冲突Moyano、ColombattiOlivii、Alonso、Romero和Romano是阿根廷国民调查委职业成员

感知感知

INTACastelal公司生物技术学院和PID 2015-061公司(Dra Maria Isabel Romano)提供赠款支持此项研究。苏尔迪圣达菲作者感谢Dra Julia Sabio批判阅读手稿