抽象性

寄生虫病毒高发率和高死亡率导致全球家禽生产经济大幅下降聚酚是绿茶的主要成分 具有巨大的抗病毒效果这项研究旨在评价多苯-60反APMV活动12个APMV-1菌株代表三种不同的病态类型、2个APMV-2菌株、1个APMV-3菌株和1个APMV-7菌株在鸡胚中传播确定细胞毒性效果时,鸡胚分片用各种富集度测试复合体处理评估抗病毒特性时,对细胞和鸡胚模型都进行了依赖时间实验和依赖毒理实验。增毒测试测量抗病毒吸附鸡红细胞表层受重构抑制测试检验结果表明,因果和因果APMV-1菌株、APMV-3菌株和APMV-7菌株大受抑制(APMV-7菌株)。 )by monphone-60 at 50华府g/ml化合物50%细胞毒性集中度为345华府g/ml.Polyphen-60还展示NDV抗仿活动综合结果显示,聚苯-60显示有希望作为一种抗病毒剂,对APMV具有宽广安全边际性,挑战性研究评价其在鸡体内的功效是必要的

开工导 言

遍及世界范围各种禽类检测到Avian pariso病毒,并产生可变临床结果和经济影响一号..纽卡斯尔病毒(NDV)正式命名为aviena parmyxo病毒血清类型-12..NDV菌株可因鸡注射的致病性而分辨高毒性(增生性)菌株引起急性感染高死亡率、双边结膜炎并发前先有呼吸道和神经标志或腹部出血损[3..后代致病性指数值比1.5强中度毒理素素素数从0.7到1.5不等,引起轻微萧条、低死亡率并减少产卵群低毒或非病原生菌株可能在低死亡率小鸡中只产生温和呼吸信号,降低鸡蛋产值,IPCI值小于0.74..

APMV包装单串非分解负RNA基因组14.9至17.4kb并编码至少六种蛋白质:Nucleocapsid(N)、Protein(P)、M矩阵、聚变(F)、Higglutinin-neuramidase(HN)和大聚合素[L5..受体识别并绑定主机细胞表面启动NDV感染后,由HN蛋白和F蛋白综合作用混合6,7..防疫方案为防ND暴发提供重要保护,但病毒仍然对商业家禽作业以及后院生产者构成潜在威胁,原因是病毒突变导致疫苗效果下降[8..自然药用产品被认为是发展中国家消除该疾病的辅助性措施。

聚酚是绿茶的主要成分,吸引科学和消费者界对其健康利益给予极大关注。Catechin(C)、eclicatechin3-gallate(EGCG)、Centratechin(ECG)、Cindapoltechin(EGC)和Centechin(EC)是多酚活性成分九九..各种生物和药理活动使用绿茶多芬醇,包括杀毒药、抗菌素、抗菌素、抗菌素、抗病毒素和抗寄生物活动九九-16..多前研究报告,绿茶多酚抗病毒机制,特别是EGCG,涉及病毒附加和基因组合成阶段[九九..绿茶多酚对NDV以及其他APMV血清类型生长的抑制作用尚未得到证明。

因此,这项研究旨在评价绿茶多芬醇(polyphen-60)反APMV活动

二叉材料方法

2.1.细胞文化、病毒和复合

鸡胚纤维素细胞在Dulbeco变形鹰介质(DMEM)(Gibco,Invitrogen)中培养,并配有10%子小牛血清(FCS)、100IU/mlpenicllin、100mg/mlsteptomycin和2mmlLglutam₂.APMV血清类型列表一号脱机全部报告前17并传播 Alantoity十天鸡胚胎制作病毒存储静脉流水采集测试放大作用,然后冷冻到-80摄氏度使用Polyphen-60摘自绿茶Louis Mo.所有实验都使用储量溶液1 mg/ml编译分解水华府m-pore尺寸针头滤波解析法在组织培养介质中解析体外实验或蒸馏水中解析维沃研究

2.2.Hemaglutinin和Higglute

HA解析测量病毒缩放V底线96水流板上的每一口井都配有25华府PBS一版后排25华府上位受感染细胞或受感染胚胎液加到板上第一排的每一口井中二次串行稀释直到板上第二口井上一口井用作控制井并填满PBS接二五华府0.5%鸡红细胞悬浮加到每口井中,允许盘保持室温45分负结果显示为井底中心红点,正结果显示为井底成块病毒tips显示为HA单元并判定为病毒逆向最后一次稀释显示完全分解

HI解析研究聚苯-60病毒吸附鸡表层抑制效果18号..简言之 25华府l(4HAU)NDV混合华府i聚苯-60异聚96井板内30分室温混合后加50华府0.5%鸡房温度45分测试周期后观察到多苯-60阻抗层叠加无聚苯-60病毒被用作负控件,PBS则用作正控件

2.350%组织文化传染多斯和50%Embryo传染多斯

PBS用于编译病毒存储量八十倍串行稀释破解_50码解析使用可分式CEF单层96水井平底板用20华府稀释一小时病毒感染后,超级目录代之以100华府内含5%FBS监测细胞分治效果时,板块在37摄氏度时孵化5天EID_50码解析使用9天SPF鸡胚5个胚胎鸡蛋各用0.1毫升稀释并孵化四天孵化期后,所有鸡蛋都测试HA活动破解_50码和EID_50码timents使用Reed-Muench方法计算19号..

2.4.循环毒性解析

多苯-60细胞毒浓度使用amarBlue解析法评价单层CEF槽平面96水板三次用PBS冲刷并处理100华府l无血清介质多苯-60或留置未经处理控制每一次集中作用三次电池在37摄氏度插入48小时以允许扩散,然后染色10%amar蓝度(Serotec,Oxon,UK),在37摄氏度时4小时微板阅读MTP-650FA测量波长562NM和595NM(Corana Electrict,Hitachinaka,Jap百分比减法使用制造商公式计算:_LW-(A)_HWxxR₀测试井/A_LW-(A)_HWxxR₀)控制井x100校正因子₀)用下列公式计算:R₀=AO_LW/AO_HW.CC_50码值使用线性回归分析测定

2.5Dose和Veruence依赖性解析

静态CEF单片48well扁板_50码并孵化1小时37摄氏度细胞用PBS三次清洗非吸附病毒,并用含有期望聚苯-60的介质处理每一集中度均以三重形式执行每天观察主机单元CPE上传经过48小时编程后,amar蓝检验工作如上所述进行。无病毒井表示100%抑制CPE带病毒感染水井负控制表示0%抑制百分数抑制CPE使用下列公式计算:(PR值):_药处理PR值_{negative control}//(PR值)_{positive control}PR值_{negative control})x10020码..

2.6病毒抗病毒活动

12个APMV-1菌株代表三种不同的病态类型、2个APMV-2菌株、1个APMV-3菌株和1个APMV-7菌株在鸡胚中传播闭合CEF单片块96well扁底板上4HA单元/25用病毒菌株注射华府并孵化于37摄氏度与PBS三次清洗后,细胞与介质叠加多聚-60并孵化48小时超生机采集 病毒编程由HA解析

2.7Ovo反病毒活动

每种集中度(20度)华府g/ml和50华府/ml多芬-60混合等量ndV_50码.病毒合成混合体被注入5个10天长鸡胚负胚胎注入病毒和PBS阳性胚胎只用PBS孵化Embryo可行性日检Emblyo死亡记录为CAM可见血管分解的标志,血液渗入Yolk或 Alantoic流体区,分布式凝固外观,没有胚胎运动,鸡蛋夜间冷冻最长24小时 死胚胎都丢弃单向流水采集,HA测试单向流水中NDV的存在胚胎存活率记录在第5天(120h)接种后

2.8增时解析

进行了时间增试调查多苯-60对病毒感染不同阶段的抗病毒效果封装式CEF单片板96-well受NDVB1菌株感染_50码.聚苯-6050华府g/ml以不同时间间隔增入细胞:感染前1小时、受感染时1小时和病毒感染后1小时6小时12小时病毒合成混合物在37摄氏度时孵化48小时使用上文描述的amarBlue解析评估聚苯-60抑制效果

2.9统计分析

数据表示平均++SD三次独立实验方法差异使用Specients分析t级测试统计意义被视为 值 < 0.05

3级结果

3.1.Polyphen-60环毒

聚苯-60的细胞毒性使用亚可分单层CEF计算,并使用amarBlue解析测量低密度10华府g/ml至100华府g/ml显示细胞可行性百分比大于90%,而富集度大于400华府g/ml排减50%以上细胞可行性一号)CC_50码值估计回归分析345华府g/ml.

3.2反病毒活动

NDV有三种不同路径类型,包括增生菌株(NDV/Miyadera/51)、采生菌株(NDV/Komarov/40)和后生菌株(NDV/Ishii/62)_50码和聚苯-60不同富集度(0)华府g/ml20华府g/ml,50华府g/ml,100华府g/ml和200华府g/ml备案抗病毒活动使用剂量和毒理依赖测试并用alamarBlue测试CEF细胞在多苯-60存在或不存在时受NDV感染显示病毒诱发CPE差分下降2(a))中生病毒感染细胞50分院治华府g/ml显示CPE小于未处理细胞相生病毒感染细胞用显示细胞形态相似控制细胞(未受感染细胞)的相同浓度处理高百分数受含油菌株阻塞为79%,集中度为50华府g/ml.最小集中度20华府g/ml抑制率小于50%受感染细胞多苯-60处理并富集度为100时还发现强抑制率华府g/ml和200华府g/ml.在同一富集度中,中生和增生株最大抑制率分别为++32和202(b))

深入调查聚苯-60是否可以防止APMV复制,CEF细胞使用APMV类型-1进行接种,代表三种病理类型(诱导型、代导型和开导型)、2至3级和7级HA单元/50华府并用0 mg/ml、20mg/ml、50mg/ml和100mg/ml的不同富集度处理高剂量聚苯-60显示病毒HAti₂HAU受二类土生菌株感染(NDV/HitcherB1/48和NDV/Ishii/62)、三类单生菌株(NDV/Komarov/40、NDV/Tochigi/95和NDV/Kumamoto/2000)和APMV-3和APMV-7同样的剂量显示受增生细胞(NDV/Sato/30和NDV/Taka/73)和两株APMV-2菌株感染病毒HA病毒HA测试细胞受高生NDV菌株感染(NDV/Niigata/85、NDV/Tokyo/96、NDV/Ibaraki-2/99和NDV/Chiba/2001)相似于未处理细胞一号)

3cm3Ovo反病毒活动

扩展发现时使用鸡模型评价聚苯-60的抗病毒活动结果表明多苯-60延长时间并增加胚胎生存率未处理胚胎受增生菌株(NDV/Miyadera/51)感染后48小时内死亡百分位求活处理后60小时和72小时只有20%受诱导菌株(NDV/Komarov/40)感染的胚胎在治疗后72小时和84小时以上没有生存对比之下,所有胚子都受开源菌株(NDV/Ishii/62)感染并用50处理华府g/ml多芬-60活到接种后5天(120小时)(表5)2)

3.4.时间依赖性内特效

确定NDV生命周期受聚苯-60阻塞阶段时进行了时间补充解析图中显示3最大抑制率为0hpi80%阻抗率降为小于50%,多苯-60加到6hpi和12hpi预处理细胞中复合抑制率仅为17%结果表明聚苯-60影响病毒生命周期初级阶段

3.5Higgluting生成Polyphen-60

确定聚苯-60对鸡块RBC表面吸附病毒的抑制效果时,进行了HI测试在所有浓度测试中,聚苯-60完全抑制HA活动NDV/Ishii/62(增生性)最大富集度(50)多苯-60后没有染色华府g/ml与NDV/Komarov/40(Mesogent)和NDV/Miyadera/51(Violent)菌株混合4)检测结果显示聚苯-60可能附着病毒并预防抑制仿真的病毒-RBC绑定

4级讨论

APMV感染继续作为一种疾病威胁出现在火鸡和鸡中21号..预防AMPV传播的选项包括应用充分的生物安保措施、限制鸟类运动、隔离疑似群鸟、抓获受感染鸟并使用防疫注射后院家禽生产系统生物安保度低、疫苗不足、抗原变异、免疫响应时间短和免疫抑制导致动物群和环境恶性NDV持久[22号..开发有效抗病毒复合物并配防疫方案对APMV的预防和控制产生积极影响

先前多项研究使用exgallatechin-3golate(EGCG),这是绿茶的主要多酚,对各种人和动物病原体病毒使用集中度50华府M,EGCG高效抑制乙型肝炎复制23号..在同一集中度上,EGCG抑制丙型肝炎病毒(HCV)在病毒生命周期初级阶段感染90%以上20码..EGCG高富集度华府+++x2型病毒(HSV-2)分10到20分减量,HSV1分减量30到40分减量[HSV-1分30到40分减24码..Catechins案(195年)华府g/ml完全抑制SARS-COV抗原合成25码..富集度为10克/千克绿茶,副产品展示重大抑制性活动 )H9N2禽流感病毒鸡类26..EGCG(50)华府硫酸锌和银纳米粒子加在一起显示强抗病毒活动 )反H5N1AIV,并减少日志机病毒7.6倍27号..EGCG组合(25)华府和硫酸锌展示强抗病毒活性 )PPRV病毒28码..王等[29发现茶多酚抑制PRRSV加载病毒附加阶段、内化阶段、复制阶段和释放阶段但这些研究都未使用茶类多酚对APMV进行抗病毒活动

在这次研究中,茶类多酚展示CEF细胞和鸡胚子对NDV感染的抑制性活动富集度、毒株和药添加时间影响复合抑制程度聚苯-60处理细胞时,发现聚苯-60明显抑制作用(多苯-60见效,富集度为50g/ml)(0时见/ml)( )聚苯-60还大减 )HA二类自导和三类自导NDV菌株APMV3和APMV7实验多苯-60华府g/ml延长受中生和增生菌株感染的胚胎生存期在同一集中度下,它完全保护受土生菌株感染的胚胎免死单片-60显示四维生成NDV菌株无抑制效果(NDV/Niigata/85、NDV/Tokyo/96、NDV/Ibaraki-2/99和NDV/Chiba/2001),而未在复合物的任何聚点观察到病毒活动

HA解析用在许多研究中量化病毒传染单元30码-32码敏感度严重受限 当它与实时PCR解析三十三..研究受限使用HA解析量化病毒缩片APMV株式测试四种不同的血清类型(APMV-1、APMV-2、APMV-3和APMV-7)和三种不同的病理类型(Velogent、Meserence和LisoHA解析比实时PCR解析更简单低成本解析产生结果HA量化测试结果10NDV菌株可用以比较组内和组间单片段实时量化PCR测试结果仅用于组间比较故本研究使用HA解析而非实时PCR解析

通过介质膜聚变,NDV聚变蛋白可能影响病毒感染和致病性6..多元-60抗病毒活动在NDV三种病理类型中大相径庭复合物显示强抑制仿真土生菌显示中微抑制活动检测结果显示多苯-60抑制病毒细胞与F0蛋白互换(高压菌株),但不与F蛋白质互换(病毒菌株)。Vero细胞受AviulentNDV(Lasota)菌株感染并用fucoidan处理后,也得出类似结果34号..光线抑制观察时CEF细胞在NDV感染前与复合物预处理单层细胞沉积可能防止病毒吸附NDV通过HN绑定网站绑定鸡 RBCs35码..推理抑制检测结果显示多苯-60可能与NDV绑定,从而抑制HA病毒活动

几千年来茶耗表示茶和茶多酚中毒性风险较低36号..在这次研究中,聚苯-60未对CEF电池造成重大损害,富集度小于350华府g/ml抗病毒有效剂量介于50华府g/ml至200华府g/ml.聚苯-60被发现宽安全边际

鸟中各种材料在Voo应用包括疫苗、药、荷尔蒙、前生素和前生素、pepti37号..常规补充路线,如填水和水中路线比以备投送生物活性物质慢38号..多项研究使用ovo模型评价草药提取物抗病毒效果,而不是使用鸡模型27号,三十九,40码..鸡胚是一种廉价高效筛选药发现模式41号并完全可用生物模型 科学实验应用42号..然而,Vob与鸡模型结果间的差异有时会发生,例如dsRNA在Vo和体外有抗病毒活动,但在孵化后没有鸡40码..管理路线差异和动物年龄差异可能促成了这种差异研究结果显示多苯-60在ovo和体外模型中的抗病毒效果未来鸡临床试验对支持有效使用多苯-60作为家禽单治法十分必要

5级结论

考虑新出现NDV和其他APMV,使用绿茶聚苯-60对抑制病毒感染有帮助研究结果显示,多苯-60对体外APMV和VO模型产生抑制作用可开发成具有宽安全边际的潜在抗病毒剂未来将探索挑战研究评价鸡群效率

数据可用性

支持这项研究使用的所有研究数据都包含在手稿中

利益冲突

撰文者声明,此论文的发布不存在利益冲突问题。

感知感知

作者高度肯定北海道大学医学院疾病控制系传染病实验室提供设施这项工作得到了日本促进科学学会科学赠款支持(IDno/P06224.