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Michael Fasullo, Yifan Chen, William Bortcosh, Minzeng Sun, Patricia A. Egner, "黄曲霉毒素B1- 已分配的DNA加合物延迟S相和刺激RAD51焦点酿酒酵母酿酒酵母",核酸杂志, 卷。2010年, 文章的ID456487, 9 页面, 2010年. https://doi.org/10.4061/2010/456487
黄曲霉毒素B1- 已分配的DNA加合物延迟S相和刺激RAD51焦点酿酒酵母酿酒酵母
抽象的
空军基地1是芽殖酵母中的一种有效的重组体。空军基地1暴露诱发RAD51.表达和触发表达人CYP1A2的酵母细胞中的RAD53活化。然而,它是未知的,而且如果出现RAD51焦点。在此,我们表明RAD53激活与酵母中的细胞周期延迟和随后形成RAD51焦点相关。与暴露于X射线的细胞相反,其中Rad51焦点仅在G2单元中出现,在AFB中的RAD51 Foci1一旦细胞进入S阶段,就可以出现 - 散步细胞。虽然RAD51和RAD4.突变体对AFB有点敏感1,长期暴露的缺乏RAD4.细胞到afb1导致滞后时间增加RAD4 RAD51.双突变体表现出协同敏感性并且在暴露于50时不会生长 μ.MAB.1.我们建议RAD51.在AFB复制叉停止或崩溃后,促进DNA复制的功能1- 散步细胞。
1.介绍
肝细胞癌(HCC)在全球癌症死亡率中排名第五(审查,见[1])和美国的第六个[2].HCC的高风险因素包括暴露于基因毒素,例如霉菌毒素黄曲霉毒素B.1(AFB.1),以及感染乙型及丙型肝炎病毒[3.].暴露在空军基地1由于中国和撒哈拉以南非的特定地区是特有的黄曲霉(霉菌)食物和水的污染[3.].目前的假设是慢性肝损伤后肝细胞的再生使肝细胞易受AFB的影响1相关的致癌作用[4].
HCC发病机制与突变的积累和染色体重排相关,导致肿瘤抑制基因的灭活或激活癌基因(用于审查,见[5])。MicroRNA-221(miR-221)过表达有助于肝脏肿瘤发生器[6]并与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p57的下调相关[7];但是,与AFB没有已知的相关性1曝光。p53(Ser)249替代突变常发生在肝癌,其中AFB1曝光是最高的[8- - - - - -10.];然而,p53 249密码子是否是AFB的直接热点,目前的报道并不一致1- 诱变诱变[11.].还观察到总染色体易位和基因扩增[12.], 10%-20%的hcc含有细胞周期蛋白D扩增[13.].虽然HCC与AFB相关联1与非洲血症区域的HCC相比,曝光表现出更多的遗传不稳定[14.[目前还不清楚哪种类型的遗传不稳定直接由AFB引起1相关的DNA损伤。
空军基地1不是遗传毒性本身但需要代谢激活。在人类,afb1肝脏中的代谢活化由CYP1A2和CYP3A4催化[15.]形成高度不稳定的afb1-8,9- exo-环氧化物,主要与n反应7鸟嘌呤的位置,存在于DNA的主要沟槽中[16.].得到的加合物,8,9-二氢-8-(n7- 胍)-9-羟基溶毒素B1(AFB1-N7-鸟嘌呤)不稳定,可转化为甲脒嘧啶(FAPY)衍生物或无嘌呤位点[16.],潜在的诱变[17.].咒语衍生物和afb1-N7- 核苷酸加合物由核苷酸切除修复(ner)基因进行修复[18.,19.].饲法加合物也阻碍了DNA复制[20.],这可能导致染色体破裂,并且需要在双链断裂和X射线修复(XRCC)中起作用的DNA修复基因。因此,修复了afb1- 分配的DNA损伤可能需要NER和XRCC基因。
有趣的是,已知多态性的子集[21.]在Ner基因XPD和X射线修复基因XRCC3中,XRCC3与肝癌中的肝癌发病率更高,在AFB的地方1接触 [22.,23.].有缺陷的人可能导致DNA加合物的增加,而XRCC3多态性可能会赋予双链休息的缺陷修复(进行审查,见[24.])。然而,XRCC3,Thr241met中的多态性,与较高水平的AFB相关1相关的肝细胞癌(23.],尚未与双链断裂修复中的缺陷相关联[25.],表明DNA损伤或修复中的其他功能在含有这种等位基因的细胞中可能有缺陷。考虑到重组修复也可能参与DNA损伤耐受途径,重要的是阐明是否存在竞争对手的DNA修复途径1- 分配的加合物。
酿酒酵母酿酒酵母(萌芽酵母)可用于阐明AFB的DNA修复的遗传1-DNA加合。表达人类的酵母菌株CYP1A1要么CYP1A2多拷贝2上的CDNA μ.质粒可以测量代谢活性致癌物质的遗传毒性[26.- - - - - -30.].有趣的是,Afb.1增加重组频率,而不是表达这些CDNA的细胞中的突变频率[26.,29.].
AFB的遗传毒性1在酵母[26.- - - - - -29.]与参与重组的DNA修复基因的转录相关,包括RAD51.[27.,30.] 和RAD54.[30.].RAD51.已经在暴露于AFB的日志相细胞中观察到诱导1[30.),而RAD51.过度表达部分抑制了重组缺陷MEC1.null checkpoint突变体[27.].RAD51.AFB也需要1- 分配的姐妹染色体交换(SCE)[29.].这些结果表明RAD51.当细胞暴露于AFB时,可能刺激重组1- 分配的DNA加合物。
在逻辑相酵母培养物中,AFB1是一个诱惑[28.].微阵列分析不仅显示出强烈的诱导RAD51.和RAD54.同时也下调了编码组蛋白的基因转录本[30.].RAD51突变体表现出AFB的增加1- 分配的突变[28.].既afb1-相关突变和重组事件需要检查点基因[28.,29.].考虑到这是afb1曝光触发检查点激活和S期延迟,似乎可能对AFB的基因毒性反应1被停滞复制叉的结果。
在本文中,我们表明RAD53激活与酵母中的S期延迟和随后的RAD51焦点形成相关。一种RAD51.缺陷的缺陷菌株导致高水平的致死性。我们建议在S期间可能发生Rad51焦点形成,并且与DNA病变无差异旁路相关。
2。材料和方法
2.1。菌株和媒体
标准培养基用于酵母细胞的培养物。YPD(酵母提取物,蛋白胨和右旋糖),SC-TRP(合成完全缺乏色氨酸)和SC-URA(合成完全缺少尿嘧啶)和FOA(5-氟甲酸)在Burke等人中描述。[31.].本研究中使用的酵母菌株的基因型列于表中1.RAD4.,RAD51和RAD4 RAD51.测量SCE和AFB的菌株1敏感性来自YB163,其中包含他3串联的重组基材TRP1[32.].ura.-衍生品的RAD4., 和RAD4 RAD51.在FOA培养基上选择菌株。LSY1957是Fung等人的礼物。[33.].pRS424-CYP1A2通过插入囊将来自PCS316的CYP1A2片段进入PRS424并通过选择TRP引入酵母菌株+转化体。
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该标题下的菌株是对S288C的含量。除非表明,否则所有基因型与YB163相同。 |
2.2。测量DNA AFB1- 分配的重组和Rad51焦点
测量机器人1- 酸性遗传毒性事件,对数相酵母细胞()在选择性培养基(SC-URA或SC-TRP)中离心并浓缩5倍。细胞暴露于50 μ.MAB.1以前溶解在DMSO中。为了在G1中同步细胞,将记录相暴露于10个-4M α因子(Sigma Co.)孵育2h,光镜下可见G1细胞。在致癌物暴露期间,细胞在选择性培养基(SC-URA或SC-TRP)中维持,然后在H2O.为了测量SCE频率,在SC-HI上选择重组,通过电镀合适的稀释度测定活力。为了可视化Rad51焦点形成,将细胞重悬于选择性培养基(SC-TRP或SC-URA)中并固定在玻璃载玻片上。
为了确定电离辐射是否刺激Rad51焦点的形成,将细胞在H中洗涤一次2o,重新悬浮在10毫升H中2o,并放入81毫米的培养皿中。使用Nordion 1.8 KCI在6 krad照射细胞137.CS辐照器(6 krad / HR)。在辐照细胞中浓缩以YPD培养基并固定在玻璃载玻片上。
2.3。活细胞ePifluocence和显微镜分析
用于显微分析的细胞在合成培养基中生长至早期中木阶段过夜。暴露于遗传毒素后,通过离心收获细胞,洗涤两次,然后重悬于ypd中。通过混合等体积的细胞悬浮液和1.4%的低熔融琼脂糖来进行细胞的固定化。如Lisby等人所述,用蜡混合物密封盖子。[35.].使用Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜可视化幻灯片。
2.4。FACS分析
通过荧光活化的细胞分选仪(FACS)可视化细胞,以将其DNA含量与其细胞循环相直接相关。在afb之后1将细胞清洗,用0.1 M柠檬酸钠重悬,用1 mg/ml RNase A在50°C下处理1小时。8 .将细胞置于50°C孵育5小时μ.g/ml蛋白酶kμ.然后在FAS分析之前将以0.1M柠檬酸钠稀释的G / mL碘化钛(PI)在细胞中加入到细胞中,终浓度为12.5 μ.G / mL PI,并通过使用BD LSR II流式细胞仪分析荧光含量。
2.5。DNA加合物的检测和定量
测量afb1- 酵母中的分配DNA加合物,我们使用液相色谱 - 电喷雾电离串联质谱(LC-ESI / MS / MS)[36.].酵母表达人CYP1A2 (pCS316)的对数期培养物暴露于50μ.MAB.14小时。因为用于分离酵母DNA的标准方案涉及碱性缓冲液,因此呈现高度不稳定的空气1-N7-鸟嘌呤DNA加合物不稳定,我们修改了“粉碎和抓取”协议[37.[我们使用含有10mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM NaCl,2%Triton X-100和1%SDS的中性缓冲液,从酵母细胞的两个独立样品中分离DNA。通过高效液相色谱和串联质谱(LC-ESI / MS / MS)鉴定并测量DNA加合物(LC-ESI / MS / MS)[36.].
2.6。确定RAD53激活
用Western blot检测Rad53的活化情况。细胞接种于SC-URA培养基中。指数期细胞()集中3倍于SC-URA,暴露于50μ.MAB.14小时。洗涤细胞两次H中2○,将等分试样直接在SC-His上铺设以测量重组,适当地稀释和镀在YPD上以测量活力。如前所述制备蛋白质提取物,如Foiani等人所述。[38.],在10%丙烯酰胺/ 0.266%双丙烯酰胺凝胶上分离,用于RAD53检测并转移到硝酸纤维素膜上。使用山羊抗Rad53(YC-19,Santa Cruz,Biotechnology,Santa Cruz,CA),通过Western印迹检测到RAD53。二次抗体是脱硅IgG-HRP(Santa Cruz)。
结果
3.1。延迟细胞周期进程与RAD53激活相关
我们以前观察到,暴露于AFB的日志相块1图表Rad53激活[29.],这可能是由复制堵塞或延迟产生的。在连续暴露于50后,我们测量了日志相位细胞中的Rad53激活和细胞周期延迟 μ.MAB.1.数据显示,3小时接触到AFB后,RAD53的峰值激活1.三个小时的暴露也足以观察SCE重组剂的时间(图1).经过4小时的AFB1暴露后,Rad53活化较少,细胞周期继续进展。细胞周期的短暂延迟与之前的研究一致,表明AFB1- 曝光酵母表现出瞬态S期延迟[30.].数据表明AFB之间存在相关性1- 分配的RAD53激活和S期延迟。因为afb.1在S期延迟后在循环细胞中检测到加合物[29.[我们推测细胞积极忍受AFB1- 在DNA复制期间分配的DNA病变。

(一种)

(b)

(C)
Rad53不仅延迟细胞周期进展,而且还需要RAD51 Paralogs的磷酸化,RAD55和RAD57,这可以在停止的复制叉时促进复制重新启动[39.].RAD55和RAD57促进在双链断裂处形成DNA修复灶[40].以前的数据表明DNA损伤需要RAD53相关的SCE [41.],包括afb1- 分配的SCE [29.].因此,我们确定了吗?1暴露也会刺激酵母中Rad51病灶的形成。
3.2.暴露在空军基地1结果在进入S相的细胞中形成Rad51焦点形成
可视化由AFB产生的RAD51焦点1-相关DNA损伤,我们将pRS424-CYP1A2导入菌株LSY1957 [33.]代谢地激活afb1.该菌株(YB405)含有RAD51-I345T.的等位基因RAD51.,当用YFP标记时,仍然能够赋予辐射抗性[33.].作为阳性对照,将细胞暴露于X射线(2 krad)或γ射线(6 krad)。暴露后,将细胞返回生长培养基(YPD),并将活细胞成像为RAD51焦点。在ypd中2小时的生长后,大多数辐照细胞在G2中被捕并呈现哑铃形状(图2).然后用共聚焦显微镜观察细胞。近90%的G2被捕的细胞包含Rad51焦点,同意Lisby等人。[40].

(一种)

(b)

(C)

(d)
同样,我们确定rad51焦点是否在暴露于50后出现在细胞中 μ.MAB.13小时。首先确认AFB的存在1加合物,我们在AFB后从LSY197细胞中提取DNA1暴露并观察到大约相同数量的DNA加合物(表2)如前所述,以用于测量重组的菌株[29.].3小时后1接触,我们还观察到,近90%的细胞表现出Rad51焦点。然而,与辐照细胞的差异很多?1展示RAD51焦点的散射细胞不是G2被捕。此外,许多细胞在母亲和女儿芽中展示了Rad51焦点(图2).这些数据表明了afb1- 分配的Rad51焦点不限于细胞周期的G2相位。由于子芽在共聚焦显微镜中并不总是可见,因此我们决定在G1中同步细胞,使细胞暴露于AFB1然后可以确定何时检测到RAD51焦点。
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一个相关基因型,见表1对于完整的基因型, b , c比:空军基地1在应变中加合物rad突变场/空军1野生型加合物(YB163)。 |
为了确定细胞是否能在S期表达Rad51焦点,首先用α因子将细胞阻滞在G1,然后暴露于AFB1了三个小时。然后洗涤细胞并返回到不含AFB的生长培养基中1.我们观察到新芽的细胞(90%)含有Rad51焦点。在30分钟或1小时孵育时间后,Rad51病灶在孵育后的孵育时间不明显,但在1.5小时孵育后显而易见;孵化三个小时后,少数Rad51焦点。这些数据表明可以在进入S相的循环单元中观察到RAD51焦点。
3.3。RAD4.细胞在AFB的切除中有缺陷1DNA加合物
ner和重组修复突变体对afb适度敏感1[27.,28.].两个都RAD4.和RAD51突变体表现出更高的AFB速率1- 诱变诱变[29.,30.].DNA加合物的测量表明,较高水平的AFB含量约为三倍1-N7- 鸟嘌呤加合物RAD4.,与野生类型相比(表2).与afb的概念一致1加合物持续更长时间RAD4.突变体,我们观察到FACS分析暴露于10后的延迟S期 μ.MAB.1.我们询问野生类型,RAD4., 和RAD51突变体可以耐受DNA加合物。
我们在Microtiter Dishes中使用了生长测定[42.]确定野生型生长曲线(YB401)的差异,RAD4.(YB403),RAD51(YB402),RAD4 RAD51.(YB404)慢性接触到AFB的菌株1.大约105将细胞接种在96个孔板中并暴露于0 μ.M,25 μ.M和50. μ.米Aff.1;实验一式三份完成。通过衡量增长(图3.).滞后时间[42.]对于野生型,是〜3小时和类似的RAD51.而这件事RAD4.突变体表现出更长的滞后期,〜13小时,RAD4 RAD51.突变体呈现很少,如果有的话,增长。数据表明RAD51.功能对于赋予AFB至关重要1抵抗抵抗力RAD4.突变体。此结果与以前的结果一致RAD14 RAD51细胞也对AFB的协同敏感1[30.].

(一种)

(b)

(C)

(d)

(e)

(F)
进一步调查RAD4.细胞可以通过在DNA加合物存在下通过S期进行,我们被捕RAD4.G1中的细胞与α因子和暴露细胞到afb13小时。然后将细胞冲洗、稀释,接种在YPD板上,每3小时在显微镜下观察单个菌落的生长情况。12小时后,约70%(46/67)的细胞未暴露于AFB1形成殖民地。但是,仅〜16%(46/268)暴露于AFB的细胞1(10. μ.μ.或50. μ.μ.)形成殖民地。60%()野生类型或RAD4.形成殖民地的细胞保留了URA3.- 筛查表达CYP1A2的质粒,表明在细胞中形成菌落形成,仍然可以代谢激活AFB1.许多人中很多RAD4.不形成菌落的细胞在早期的阶段被捕,因为小女儿芽的存在是显而易见的(图3(f)).这些数据表明,几个缺陷的细胞可以在AFB的存在下通过细胞周期进行1- 分配的DNA加合物。
4。讨论
空军基地1是一个非常有效的肝脏致癌物。AFB的代谢激活1生成afb.1- 在各种生物中刺激诱变和重组的分配的DNA加合物。XPD和XRCC3中的多态性与更大的HCC风险相关[22.,23.],强调需要阐明重组修复在AFB中的作用1新陈代谢。在出芽酵母中,AFB需要保守的RAD和检查点基因1-相关的突变和重组[28.,29.].AFB的频率较高1- 分配突变RAD51突变体(28.,29.] AFB中的协同增加1重组和ner两者双突变体缺陷的敏感性表明,在赋予AFB的抵抗力方面存在冗余途径1.空军基地1高度重组和诱导RAD51.在酵母[27.];但是,何时何时和RAD51焦点形式。本研究的显着结论是(1)细胞在AFB后的S相中延迟1曝光,与RAD53检查点激活和细胞周期延迟有相关性;(2)AFB后RAD51焦点形式1- 散步细胞进入S相;(3)RAD4.突变体积累了afb1-N7- 鸟嘌呤加合物,以及许多暴露的细胞停止或延迟在S期。这是第一项展示afb的研究1暴露导致Rad51焦点形成。
以前的研究表明RAD53.适用于AFB1-酵母中相关的重组和突变[29.].重组的一致时序,Rad53检查点激活和S相位延迟表明,需要检查点激活来触发AFB1- 酵母中的复合重组。可能的链接是RAD51 Paralogs Rad55和Rad57的DNA损伤相关磷酸化所需的RAD53 [39.],参加姐妹染色体之间的重组修复[34.].我们尚未知道检查点激活如何触发诱变,但几项研究表明了DNA损伤耐受性和翻转合成中的检查点基因的作用[43.- - - - - -46.].
识别afb1- 通过检测共聚焦显微镜中的YFP荧光来进行 - 分配的RAD51焦点。未知Rad51与特定的DNA加合物结合,所以我们假设afb1N7- 鸟嘌呤加合物和所得到的疗法和膜的遗传位点进一步转化为重组性病变,包括双链断裂或单链间隙。启动AFB的所有病变不太可能1- 分配的RAD51焦点与X射线相关的RAD51焦点相同,因为我们观察到进入S相的新循环细胞中的RAD51焦点,而我们仅观察到G2被阻止的细胞中的X射线启动的RAD51-Foci。然而,在S相的复制叉子摊位或塌陷之后,双链断裂或单链间隙也可能导致倒置或塌陷1据报道病变术止或阻碍DNA复制大肠杆菌[17.].因此,一个有吸引力的模型是Rad51病灶形成AFB1- 散合细胞通过S相过渡。
我们建议RAD51.赋予Afb.1通过两种可能的功能缺损突变体的抗性。第一的,RAD51.可以在修理双链中的功能间接突破AFB1相关的DNA损伤。考虑到一个双链休息可能会赋予致命性[47.],一个人会估计每一个中至少有一个休息RAD4 RAD51.在慢性暴露于50期间双突变细胞 μ.MAB.1.第二,RAD51.可以积极参与容忍房地产1- 分配的DNA病变;以前的研究表明Rad52.途径参与耐受紫外线相关损伤[48.].野生型电池的生长曲线表明了一些AFB1- 可以耐受分配的DNA加合物而不会影响倍增时间。这第二可能是通过观察来支持的RAD14 RAD51突变体表现出极高的AFB频率1- 诱变诱变[28.].进一步的猜测将建议Rad51-Paralog XRCC3具有类似的功能。
5。结论
空军基地1- 分配的DNA加合物刺激检查点激活和RAD51聚焦形成。与电离辐射相比,在初期S相期间在细胞周期期间Rad51焦点的定时表明了不同的灶形成机制。理解这些RAD51焦点的功能将阐明XRCC3中的多态性如何与暴露于AFB的流行区域中的肝癌更高的速率相关1.如果在AFB之后也发生哺乳动物细胞中也发生RAD51焦点,因此它将是有趣的1曝光。
致谢
这项工作得到了补助金的支持。ES015954和PO1ES006052来自国家卫生研究院。作者们感谢加里学校为他在共聚焦显微镜,秋史密斯和Cinzia Cera的专业知识,以便于龙眼普罗特读卡器,以及Cinzia Cera批判性地阅读本文。我们感谢Chang-UK LIM与流动含细胞仪的帮助。
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