IJCB 国际细胞生物学杂志 1687-8884 1687-8876 Hindawi 10.1155/2019/3059687 3059687 研究文章 凝胶蜂蜜和5-氟尿嘧啶对人腺癌结肠癌HT-29细胞的组合细胞毒性作用在体外 http://orcid.org/0000-0001-8353-3715 T-Johari Syed Ahmad Tajudin 1 2 Hashim 法蒂玛 1 3 http://orcid.org/0000-0001-8069-2278 ismail Wan Iryani 1 http://orcid.org/0000-0002-9443-5421 Ali 阿卜杜勒·马纳夫（Abdul Manaf） 2 4 5 Corrado Chiara 1 基础科学学院 马来西亚大学 21030 Kuala Terengganu 马来西亚 umt.edu.my 2 生物库和食品工业学院 苏丹Zainal Abidin大学 22200 besut Terengganu Darul Iman 马来西亚 unisza.edu.my 3 Institute of Marine Biotechnology 马来西亚大学 21030 Kuala Terengganu Terengganu Darul Iman 马来西亚 umt.edu.my 4 农业生产与食品创新研究所 苏丹Zainal Abidin大学 22200 besut Terengganu Darul Iman 马来西亚 unisza.edu.my 5 天然医学研究中心 Universiti Islam Malaysia 63000 Cyber​​jaya Selangor Darul Ehsan 马来西亚 2019 21 2 2019 2019 11 11 2018 09 01 2019 17 01 2019 21 2 2019 2019 版权所有©2019 Syed Ahmad Tajudin T-Johari等。 这是根据Creative Commons归因许可分发的开放访问文章，该文章允许在任何媒介中不受限制地使用，分发和复制，前提是适当地引用了原始作品。

Combination of natural products with chemodrugs is becoming a trend in discovering new therapeutics approach for enhancing the cancer treatment process. In the present study, we aimed to investigate the cytotoxic and apoptosis induction of Gelam honey (GH) combined with or without 5-Fluorouracil (5-FU) on HT-29 cells. The cell viability was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay to assess cytotoxicity. Morphological changes and apoptosis were determined by the inverted microscope, Annexin V-FITC, and DNA fragmentation via flow cytometric analysis, respectively. Our results demonstrate that combined treatment revealed a remarkable and concentration-dependent cytotoxic effect on HT-29 cells in comparison with GH and 5-FU alone. Flow cytometry analysis showed that early apoptosis event was more pronounced in combined treatment. In addition, compared to 5-FU alone, apoptosis of HT-29 cells treated with combinations of GH and 5-FU demonstrated increasing percentages of fragmented DNA. Our results suggest that GH has a synergistic cytotoxic effect with 5-FU in HT-29 cell lines 体外。尽管分子机制的作用尚不清楚，但结果表明，GH和5-FU的组合可能具有治疗剂的潜力。

 苏丹Zainal Abidin大学 马来西亚大学 Universiti Islam Malaysia 1.简介

Since antiquity, honey has been consumed as a daily nutritional supplement. Its major constituent is carbohydrates such as glucose, fructose, and sucrose. Honey bees collect pollen from flowers and later convert them into honey via regurgitations and evaporations. There are several varieties of honey in Malaysia, such as Honey, Tualang Honey, and Pineapple Honey. All of these are differentiated based on their dominant quantity of pollen, which can be identified by pollen analysis as the pollen is species-specific [ 1]。蜂蜜在科学上被证明具有多种药用特性，例如抗菌药物[ 2，，，， 3]，抗氧化剂[ 4]， 消炎（药 [ 5]，抗肿瘤[ 6这是给予的，，，，和wound healing abilities [ 7]。蜂蜜内的酚类化合物，例如食道酸，氯化酸，咖啡酸，p-豆酸，阿魏酸，埃拉吉酸，槲皮素，硫代蛋白，硫代素和菊花是抗炎和抗肿瘤效应的主要因素。 6，，，， 8]。

在结直肠癌的初始治疗过程中，通常使用一种称为5-氟尿嘧啶（5-FU）的化学治疗药物。它的主要机制涉及通过将氟核苷酸的不均能分解为序列的DNA和RNA的正常功能的破坏，除了抑制胸苷酸合酶的功能[ 9]。However, 5-FU has been reported to be of low availability within the cells due to its degradation in the liver by the enzyme dipyrimidine dehydrogenase (DPD). Thus, a large dose is required during treatment [ 10]。除了对人体非常毒性外，该药物的较高剂量还会对患者产生严重的副作用。过去的研究发现，将药物与蜂蜜等天然物质结合起来可以增强其对癌细胞的影响并最大程度地减少其毒性[ 11]。与单独使用5-FU治疗不同，GH与5-FU结合使用与5-FU的使用可显着降低HCT-116细胞的生长[ 12]。此外，就caspase-9表达的上调[ 13]。

In this study, Gelam honey, 5-Fluorouracil, and their combination were used to determine the cytotoxic and apoptotic effects on HT-29 cells. Observations were made in terms of changes in the membrane integrity, fragmentation of DNA, and early events of apoptosis. These are useful for the creation of new strategies for the future treatment of colorectal cancer.

 2。材料和方法 2。1。Honey Sample

这项研究中使用的凝胶蜂蜜是从马来西亚孟买顿瓜的Busut的凝胶森林中获得的。通过将蜂蜜与RPMI-1640培养基混合并使用0.22--将蜂蜜溶液储备。 μm注射器过滤器。这项研究中使用的凝胶蜂蜜已由认可的实验室测试，并确认为纯蜂蜜。

 2.2。细胞系

人类结直肠腺癌HT-29细胞是从美国组织培养物收集（美国弗吉尼亚州Manassas）获得的。这些细胞在RPMI-1640培养基（美国圣路易斯Sigma）中生长，补充了10％的胎牛血清（美国Gibco，美国）和抗生素（即100.0单位/ml青霉素和100.0 μG/ML链霉素）（奥地利PAA）。它们在37°C的孵化器中与5％CO保持2和a humidified environment. The HT-29 cells were subcultured every 2 to 3 days in a semiconfluent condition in which they were treated with a trypsin-like enzyme and phenol red (GIBCO, USA) for 5 minutes. The cells were then resuspended in the medium with serum before being transferred into 2 or 3 new flasks. Samples with cell viability of 95% and above were selected for use throughout this study.

 2.3。MTT细胞毒性测定法

如Ali等人所述，MTT分析是在96孔板中进行的。[[ 14]。100.0 μL of complete growth medium was placed into 96 flat-bottom microtiter plate (Nunclon, USA). This was followed by the addition of 100.0 μL的HT-29细胞以1-2×10的浓度5使用前已将24小时接种的细胞/mL。将RPMI-1640培养基中的蜂蜜样品（400 mg/mL）一式三份和连续稀释的孔中等分为井中。未处理的细胞用作对照。将板在CO中孵育72小时237°C的孵化器。孵育后，20.0 μL of MTT solution (5.0 mg/mL) was added to each well and further incubated for 4 h. The culture medium was then removed from the wells and 100.0 μl添加到每个孔中的二甲基硫氧化物（DMSO），以溶解所得的甲唑[ 15]。The optical densities (OD) of the wells were analysed at 570 nm using a plate reader (BIOTEK, USA), with a reference at 630 nm. A dose-response curve of cell viability versus sample concentration was subsequently plotted.

 2.4。尖锐的橙色和碘化丙啶染色（AO/PI）分析

HT-29细胞用GH，5-FU处理，并组合为24、48和72 h。孵育24小时后，将细胞收获成离心管中，并以300×g的含量向下颗粒10分钟。如上所述，通过离心通过离心洗涤细胞颗粒。然后将颗粒悬挂在50.0中 μl acridine橙色（10.0 μg/ml）和50.0 μL of propidium iodide (10.0 μg/mL) for 5 min. A volume of 10.0 μL of stained cells was pipetted onto a glass slide and covered with a cover slip. The viable, apoptotic, and necrotic cells were scored in populations of more than 100 cells using an inverted fluorescence microscope (Nikon TE2000-U, Nikon, Japan), as described by Ali et al. [ 16这是给予的

 2。5。Phosphatidylserine Externalisation Analysis by Flow Cytometry

凋亡检测试剂盒（BD膜联蛋白V-FITC）用于流式细胞仪分析。该试剂盒包含与荧光染料FITC，碘化丙啶和结合缓冲液结合的膜联蛋白V。HT-29细胞（2×105用GH，5-FU处理细胞/mL），在6孔中的两种孔组合3、6和12 h。治疗完成后，将细胞收获成5毫升管，并在秋千转子中以300×g离心10分钟。用PBS将细胞颗粒洗涤两次，之后100 μl of binding buffer was added to the tubes. A volume of 5 μl of Annexin V FITC and 5 μl of PI were added to the tubes as a staining solution. The mixture was then incubated in the dark for 15 minutes. This was followed by addition of 400 μl结合缓冲液与每个管子的结合缓冲液。使用细胞流式细胞仪（美国贝克曼·库尔特）在分析之前将管子轻轻涡旋。大约10,000个事件被相应地分为可行的，早期凋亡，晚期凋亡和坏死细胞[ 17，，，， 18]。

 2.6。DNA碎片分析通过末端脱氧核苷酸转移酶Dutp nick-end标记（TUNEL）

根据制造商的协议（美国Becton Dickinson，美国），使用Apodirect™套件进行TUNEL分析。浓度为1×10的细胞6将细胞/mL固定在1％（w/v）用PBS（pH 7.4）的1％（w/v）多聚甲醛中固定在冰上60分钟。然后通过300×g离心5分钟，然后用5 mL PBS洗涤两次。然后将细胞重悬于70％（v/v）冰冷的乙醇中，并在-20°C下储存1周。孵育后，除去乙醇并使用洗涤缓冲液洗涤两次细胞。然后将细胞通过在50中孵育进行最终标记。 μL的DNA标记溶液（含有TDT酶和FITC DUTP溶解在反应缓冲液中）的L 60分钟。孵育后，在用0.5 mL Pi/RNase染色缓冲液染色之前，将细胞在1 mL的冲洗缓冲液中洗涤两次。在黑暗的环境中进行了30分钟的染色过程。之后，然后使用Cytexpert软件在Cytoflex（美国贝克曼·库尔特）中分析细胞。

 2.7。统计分析

数值参数表示为均值±标准误差均值（S.E.M.）。所有实验均一式三份进行，并使用单向方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Tukey的事后检验。置信度水平为p≤0.05被认为具有统计学意义。

 3.结果 3.1。凝胶蜂蜜，5-氟尿嘧啶的细胞毒性及其在HT-29细胞和正常结肠细胞中的组合

Gelam honey was examined for its cytotoxicity towards HT-29 cells using a MTT assay. The optical density of the resulting formazan blue was determined, which reflected the normal function of mitochondrial dehydrogenase in viable cells [ 15]。根据其各自的浓度确定了72小时治疗后GH，5-FU及其组合的毒性程度50）。Gelam honey reduced the number of viable HT-29 cells at a CD5036.2 mg/ml。同时，CD505-FU是15.5 μg/ml (Figure 1）。从结果，CD25和CD755-FU为6.25 μg/ml和227.4 μg/ml。CD的组合50具有三种不同浓度的GH浓度（CD25，CD50，，，，和CD75）5-FU减少了CD50of GH to 30.4 mg/ml, 13.2 mg/ml, and 2.4 mg/ml, respectively (Figure 2）。The cytotoxicities of GH and 5-FU were also tested on a normal colon cell line, CCD-18Co. The CD50CCD-18CO细胞中GH的值为89.8 mg/ml。同时CD50of 5-FU in CCD-18Co cells was 203.1 μg/ml (Figure 3）。因此，36.2 mg/ml GH和15.5的组合 μ选择G/mL 5-FU，因为两个值都低于CD50正常结肠细胞中GH和5-FU的值。计算该组合指数以确定GH和5-FU组合的协同活性[ 19]。获得的组合指数（CI）分析值小于1，表明GH和5-FU之间存在协同作用。CD50values of GH, 5-FU, and their combination (all at CD50在本研究的后续测定中使用浓度）。

治疗72小时后，GH和5-FU对HT-29细胞的细胞毒性。CD50GH为36.2 mg/ml（A）和CD505-FU是15.5 μg/ml（b）。每个点表示三个独立实验结果的平均值。误差线代表平均值±S.E.M.在三个独立实验中。 * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

GH在CD的影响50在不同浓度的5-FU孵育72小时后，HT-29细胞的活力浓度为72小时。每个点表示三个独立实验结果的平均值。误差线代表平均值±S.E.M.在三个独立实验中。 * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

治疗72小时后，GH和5-FU对正常结肠细胞（ATCC®CRL-1459）的细胞毒性。CD50GH为89.8 mg/ml（A）和CD505-FU是203.1 μg/ml（b）。每个点表示三个独立实验结果的平均值。误差线代表平均值±S.E.M.在三个独立实验中。 * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

 3.2。通过双重染色的细胞死亡模式用尖锐的橙色和碘化丙啶染色

Morphological assessments of the cells (using acridine orange and propidium iodide) were conducted to determine the modes of death of the treated HT-29 cells at CD50doses. As shown in Figure 4，，，，the number of apoptotic cells increased significantly after treatment with GH from 20.67% at 24 h to 34.67% at 48 h and 41.03% at 72 h. Similarly, in the positive control (5-FU-treated cells), the corresponding values were 7.67% at 24 h, 22.02% at 48h, and 23.01% at 72 h. The highest percentages of apoptotic cells were recorded for the combined treatment of GH + 5-FU, with values of 25.33% at 24 h, 33.05% at 48 h, and 46.67% at 72 h. A low percentage of necrotic cells was detected in the treatment groups, which did not differ significantly from the untreated group.

未处理的HT-29细胞的细胞死亡模式以及已通过GH，5-FU以及两者处理的细胞死亡模式。误差线代表平均值±S.E.M.在三个独立实验中。 * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

 3.3。磷脂酰丝氨酸外部化分析在早期凋亡事件方面

磷脂酰丝氨酸外在化是凋亡过程中的早期事件，可以使用膜联蛋白V和PI染色来评估。在这项研究中，发现在CD治疗3小时内的所有组中都检测到了凋亡的早期事件50剂量（图 6和 7）。对于GH处理的标本，早期凋亡事件的百分比在3小时时为4.66％，6小时时为6.20％，12.31％在12小时时为12.31％。在3 h时测量的后期事件的百分比为4.5％，在6小时时为3.85％，在12小时时为10.16％。在GH处理的标本中未检测到坏死事件。对5-FU处理的标本进行了类似的测量。5-FU处理的标本中早期凋亡事件的百分比随时间增加（3小时时6.66％，6小时时8.11％，在12小时时为16.56％）。但是，与GH处理的组相比，在5-FU处理的标本中，晚期凋亡事件的百分比较低（3小时时为4.41％，6小时时为3.05％，在12小时时为6.79％）。与单独的GH或5-FU相比，在联合（GH + 5-FU）治疗组中获得了较高百分比的凋亡细胞。在联合治疗中，早期凋亡事件的百分比在3小时时为7.51％，在6小时时为9.37％，在12h时为18.64％。

 3.4。DNA碎片分析：标志性凋亡检测

DNA碎片是凋亡的标志性事件之一。使用TUNEL分析对细胞中的DNA片段化进行定量评估。在治疗24小时后，HT-29细胞内部的DNA在所有治疗组中开始进行乳沟（此类细胞的百分比为4.44％，在GH治疗中为4.21％，在5-FU治疗中为4.21％，在71.67％中为71.67％。联合GH + 5-FU处理）。数字 8在联合GH + 5-FU治疗组中，TUNEL阳性细胞百分比显着增加（48 h后92.49％，在72 h后94.90％）。注意到CD的所有治疗方法50随着时间的推移，剂量增加了Tunel阳性细胞的百分比。相反，对照组在整个治疗期间记​​录了DNA裂解的发生率非常低（小于0.3％）。这表明在健康的HT-29细胞中，DNA裂解不是正常发生的，因此表明其原因是GH和5-FU的细胞毒性。

 4。讨论

Over the past few years, cancer chemoprevention and therapy using traditional medicines have garnered a great deal of research attention globally. In this study, the cytotoxic and apoptosis induction of Gelam honey (GH) combined with or without 5-Fluorouracil (5-FU) on HT-29 cell were investigated. The cytotoxic result revealed that GH exhibited the ability to reduce the viability of HT-29 cells, and in combined treatment the cytotoxic dose reduced compared with GH and 5-FU alone in time and dose dependent manner. The results also indicated synergistic effect of GH and chemoagent 5-FU in altering growth of HT-29 cells, which was quantitatively analysed according to Chou-Talalay method [ 19]。先前的研究表明，GH具有很高的总酚类化合物，这与其生物活性显着相关[ 20]。还发现蜂蜜中的酚类化合物直接导致结肠癌细胞的生存能力降低[ 21]。在正常结肠细胞中看不到类似的作用，这表明GH活性是细胞依赖性的，因此有可能用作5-FU组合的结肠癌治疗的替代方法。5-FU是一种众所周知的药物，广泛用于结肠化疗。已经建立了许多改善5-FU活动的策略，其中之一是使用联合疗法[ 22- 24]。在常见的临床实践中，5-FU与白细胞，伊立曲霉或奥沙利铂的组合已显示出这种药物活性的改善[ 25这是给予的However, side effects associated with 5-FU might hamper the effort to treat cancer patients [ 26]。With the aim of highlighting the hypothesis that GH could possibly enhance the 5-FU activity, the combinations of GH and 5-FU initiated by Hakim et al. revealed that GH can be a potential candidate to work synergistically with 5-FU [ 12]。但是，其潜在价值的发现还不够，需要获取更多数据以揭示其收益。据我们所知，迄今为止，尚无实验证据表明，凝胶蜂蜜和5-FU在HT-29细胞中分别诱导凋亡的关联。然而，仅对凝胶蜂蜜的生物活性性进行了深入的研究。凝胶蜂蜜是一种众所周知的重要物质，廉价，相对无毒，在市场上易于使用。此外，自远古时代以来，就使用了其起源的蜂蜜。凝胶蜂蜜被认为是一种潜在的癌症疗法，具有降低可行性的各种癌细胞系，例如MCF-7，HCT-116，HEPG2，A549和HT-29 [ 12，，，， 27- 30]。

许多在体外和体内的研究表明，单独的GH在通过GH治疗的癌细胞中观察到的显着抗增殖和凋亡作用[ 13，，，， 27，，，， 28，，，， 30，，，， 31]。在癌细胞中，诱导凋亡是癌症治疗的有效策略。凋亡是一种程序性细胞死亡，专注于细胞死亡领域，涉及内在（线粒体依赖）或外部（死亡受体依赖）途径[ 32- 34]。在凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内表面转向外膜[ 35，，，， 36]。We demonstrated that the phosphatidylserine (PS) was translocated as early as 3 hours after exposing the HT-29 cells to the treatment. Interestingly, the combined treatment showed that the highest percentage of PS was translocated in cells. Even though the translocation of PS has been reported in reversible process [ 37]，我们的形态检查表明，与单一治疗相比，在联合治疗中处理的细胞具有越来越多的细胞的流动特征（图 5）。这些证实HT-29细胞患有细胞凋亡，不可逆。此外，我们在DNA碎片分析中的结果表明，GH和5-FU的组合增加了HT-29细胞中碎片的DNA。DNA碎片是在凋亡途径中发生的晚期过程之一[ 38，，，， 39]。总的来说，这些发现进一步支持了以下观点：GH和5-FU的细胞毒性作用以及两种诱导的HT-29细胞中的凋亡的组合以时间依赖的方式。

治疗后24小时，HT-29细胞的荧光显微照片证据。接触治疗后的形态变化是典型的凋亡。A：可行的细胞，B：凋亡细胞，C：坏死细胞。箭头 （) shows membrane blebbing—one of the characteristics of apoptosis. This was viewed using a laser confocal inverted microscope at magnification of 630X.

Analysis of phosphatidylserine externalisation in HT-29 cells via Annexin V and PI staining using a flow cytometer. Results are presented as means ± S.E.M. of three independent experiments. * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

未处理和CD的流式细胞仪分析50- 通过膜联蛋白V FITC/丙啶碘化物（PI）染色，处理的HT-29细胞通过染色。活细胞位于左下象限，早期凋亡细胞位于右下象限，晚期凋亡细胞在右上象限，不可行的坏死细胞在左上象限。图中的每个点代表单个重复中的10,000个单元格。

DNA fragmentation of HT-29 cells after treatment with GH, 5-FU, and both. Results are expressed as percentages of cells stained by terminal dUTP nick-end labelling (TUNEL positive). Error bars represent means ± S.E.M. of the three independent experiments. * 对照细胞和治疗组之间的统计显着性（p <0.05）。

 5.结论

总之，GH和5-FU的组合在对人类结肠癌HT-29细胞的细胞毒性和凋亡作用方面具有协同结果。5-FU和GH在HT-29细胞上的协同相互作用值得进一步研究HT-29细胞上的潜在分子机制，在该细胞上应重点放在分子相互作用上，以发现途径GH在哪种途径上增强了5-FU的功效。。

 数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

 利益冲突

作者宣布，本文出版物没有利益冲突。

 致谢

作者要感谢苏丹Zainal Abidin大学生物库和食品工业学院；以及马来西亚孟买大学基础科学学院；马来西亚伊斯兰大学为马来西亚项目和教育部的技术和财政支持提供博士学位。奖学金支持。

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